ILLINOIS

Aug 17, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12763 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Docetaxel (Doc) es la piedra angular de la quimioterapia; sin embargo, el tratamiento con Doc conduce a menudo e inevitablemente a la resistencia a los medicamentos y a la formación de células cancerosas gigantes poliploides (PGCC). En este estudio, investigamos el efecto de Doc en el cáncer de pulmón de células no pequeñas para explorar el papel de los PGCC en la resistencia a los medicamentos y los mecanismos moleculares que regulan esta resistencia. Encontramos que Doc indujo la detención del ciclo celular G2/M y la muerte celular en células A549 y NCI-H1299. Sin embargo, muchas células permanecieron vivas y se convirtieron en PGCC al disminuir la expresión de proteínas reguladoras clave relacionadas con el ciclo celular y la proliferación. En particular, las PGCC mostraron características típicas de senescencia, especialmente la regulación positiva de la expresión de p21 y p-histona H2A.X. Además, el nivel de ARNm de IL-1β en el fenotipo secretor asociado a la senescencia aumentó significativamente con el desarrollo de PGCC. La inhibición de IL-1β redujo la expresión de p-histona H2A.X y promovió la poliploidía para mejorar el efecto proapoptótico de Doc. En conjunto, nuestros resultados sugirieron que la IL-1β estaba involucrada en la formación de PGCC y regulaba la senescencia de las PGCC, lo que contribuyó a la resistencia a los medicamentos Doc. Por lo tanto, apuntar a la IL-1β en las PGCC puede ser un enfoque novedoso para superar la resistencia a los medicamentos.

El cáncer de pulmón es un tumor maligno común en todo el mundo, entre los cuales el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 85% y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer1. La quimioterapia es uno de los tratamientos tradicionales y Doc es la piedra angular de la quimioterapia para el NSCLC2. En muchos casos, Doc prolonga la supervivencia global y libre de progresión, pero también conduce inevitablemente a la resistencia a los medicamentos y a la recaída después de la quimioterapia3,4. Doc es un agente inhibidor de microtúbulos que provoca la detención del ciclo celular en la mitosis, después de lo cual las células mueren en la mitosis o salen de forma aberrante (deslizamiento mitótico) y sobreviven como células poliploides5. La poliploidía es un mecanismo conservado en las respuestas al estrés, y múltiples tratamientos de estrés, incluidos los fármacos quimioterapéuticos, pueden inducir la poliploidización de las células tumorales6, lo que conduce a la formación de PGCC. Se cree que los PGCC están altamente relacionados con la resistencia al tratamiento y la repoblación tumoral después del tratamiento7,8. Aunque las PGCC se describieron hace más de un siglo y se reconocen cada vez más, los mecanismos subyacentes a su formación y su papel en la resistencia a los medicamentos aún no se han aclarado claramente.

La senescencia celular generalmente se define como un estado celular de detención del ciclo celular e inhibición proliferativa9. Este proceso se reconoce cada vez más como un concepto importante en la biología del cáncer. La quimioterapia puede inducir la senescencia celular, que es un destino diferente a la muerte celular y puede estar relacionado con las PGCC10. De hecho, las PGCC siempre van acompañadas de un fenotipo senescente, que incluye una morfología celular hipertrófica que no se divide, detención del ciclo celular y actividad mejorada de la β-galactosidasa11. Además, las PGCC constituyen una subpoblación transitoriamente senescente de células cancerosas que surgen en respuesta a la quimioterapia12. Aunque las células senescentes pierden la capacidad de proliferar, permanecen vivas y conservan actividad metabólica10. Por tanto, las PGCC pueden escapar del destino de la muerte mediante un mecanismo especial en el que adquieren un fenotipo senescente.

Las células senescentes sufren cambios metabólicos y secretan una serie de factores activos, que se denominan fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)13. Se cree que las citoquinas inflamatorias en el SASP son críticas para el desarrollo del cáncer y la adquisición de resistencia a los medicamentos14. La IL-1β es una citoquina inflamatoria importante y los tratamientos contra el cáncer pueden promover la producción de IL-1β15. Estudios recientes han demostrado que la IL-1β puede ser producida directamente por las células tumorales, lo que conduce al fracaso del tratamiento16. Aunque la IL-1β a menudo se relaciona con la resistencia a los medicamentos, el papel de la IL-1β en la resistencia a los medicamentos aún no está claramente claro.

En el estudio actual, investigamos el efecto de Doc en la formación y senescencia de PGCC en NSCLC, centrándonos en el papel de los factores inflamatorios en estos procesos. Nuestro estudio demostró que Doc indujo la detención del ciclo celular G2/M y promovió la formación de PGCC. Sobre esta base, encontramos que las PGCC mostraron características típicas de senescencia y que la IL-1β en el SASP aumentó significativamente con el desarrollo de las PGCC. En particular, la inhibición de IL-1β redujo la expresión de p-histona H2A.X (γ-H2A.X) y promovió la poliploidía para mejorar el efecto proapoptótico de Doc. Nuestros datos sugirieron que apuntar a la IL-1β en las PGCC podría ser una estrategia prometedora para revertir la quimiorresistencia al Doc.

Todos los reactivos y anticuerpos primarios utilizados en este estudio se enumeran en el material complementario (archivo adicional 1 para las tablas S1 y S2). Todas las soluciones madre se almacenaron a -20 °C antes de su uso.

Las líneas celulares de NSCLC humano A549 y NCI-H1299 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio DMEM/F-12 (Shanghai Basalmedia Technologies Co., Ltd.) con suero bovino fetal al 10% (FBS; VivaCell) y se mantuvieron en presencia de CO2 al 5% a 37 °C. Para el tratamiento con Doc, las células se trataron con Doc a 100 nM durante 24 h (h) y luego se dejaron recuperar en medio regular durante tres días. Las células se dividieron en tres grupos: grupo control, grupo Doc (24 h) y grupo Doc (24 h) + 3 días. Para el tratamiento con diacereína, las células se trataron con diacereína 1 μM durante 24 h para inhibir la IL-1β antes del tratamiento con Doc. Las células se dividieron en 4 grupos: grupo control, grupo Dia, grupo Doc y grupo Doc + Dia. Se añadió DMSO al sistema de cultivo como control del vehículo.

Se utilizaron tintes Dil (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU.) y Hoechst 33342 (Beyotime; Shanghai, China) para marcar la membrana celular y el núcleo. Las células se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos (ABC Biochemistry; Hong Kong, China) y se trataron con Doc. Luego, las células se enjuagaron una vez en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 min (min). Después de la incubación con Dil (5 μM) y Hoechst 33342 (1:100) durante 30 min a 37 °C, se visualizó la morfología de las células bajo un microscopio de fluorescencia invertida Ti-S (Nikon, Japón) con NIS-Elements D 3.2. software.

Se obtuvieron imágenes de la morfología de las células mediante microscopía óptica convencional (Nikon, Japón). Después de registrar las imágenes, todas las células tangibles (células adheridas/viables y células flotantes) se recogieron en el sistema de cultivo y se contó el número de células en una cámara de hemocitómetro bajo un microscopio.

Las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS enfriado con hielo y se fijaron en metanol helado al 80% durante la noche a -20 °C. Luego, las células se resuspendieron en 500 µl de PBS que contenía PI (50 µg/ml) y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. El análisis del ciclo celular y del contenido de ADN se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo FACS Canto® Π (BD Canto; San José, CA, EE. UU.). La distribución del ciclo celular se analizó mediante el software FlowJo 7.6 y el contenido de ADN se analizó mediante el software BD FACSDiva.

El efecto de Doc sobre la apoptosis de las células A549 y NCI-H1299 se cuantificó utilizando el kit de detección de apoptosis 7-AAD/PE Anexina-V (BD Biosciences; San José, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron y se resuspendieron a una concentración de 1 x 106 células/ml en 1 ml de tampón de unión (1 x). La suspensión celular (100 μL) se incubó con 5 μL de Anexina V (PE) y 5 μL de 7-AAD durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, se añadió 1 x tampón de unión (400 μl). Las intensidades fluorescentes de PE Anexina-V o 7-AAD se analizaron mediante un citómetro de flujo FACS Canto® Π y se evaluaron 10.000 células en cada muestra.

Las células se sembraron sobre cubreobjetos en placas de cultivo de 24 pocillos y luego se trataron con Doc. Siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante, se utilizó un kit de tinción SA-β-Gal (Beyotime; Shanghai, China) para detectar las células adheridas a los cubreobjetos. Se obtuvieron imágenes del desarrollo del color azul en las células utilizando un microscopio invertido Ti-S.

Se realizaron extracción de proteínas e inmunotransferencia17. Brevemente, las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS preenfriado. La proteína total se extrajo utilizando tampón de lisis RIPA que contenía cócteles inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche; Basilea, Suiza). La concentración de proteínas se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Se utilizaron cantidades iguales de muestra de proteína (aproximadamente 30 μg) para el análisis de transferencia Western. Se utilizó β-actina como control interno.

Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning, China) proporcionó ratones macho BALB/c-nude de seis semanas de edad. Las células humanas NSCLC A549 (5 x 105 células) suspendidas en 100 μl de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos y se les permitió establecer tumores. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones portadores del tumor se asignaron aleatoriamente a dos grupos: grupo PBS y grupo Doc, con 5 ratones en cada grupo, a los que se les inyectó por vía intraperitoneal PBS o Doc (10 mg/kg) una vez cada 7 días. para un total de 4 veces. Después de 4 semanas, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical siguiendo las Directrices de la Asociación Estadounidense de Medicina Veterinaria (AVMA) para la eutanasia de animales (2020). Los tumores fueron extirpados quirúrgicamente y fotografiados. Todos los experimentos con animales se realizaron tras la aprobación del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (N.º de aprobación CSE202108002). El estudio se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

El tejido tumoral de ratón se fijó en formalina, se embebió en parafina y se cortó en secciones de 4 µm. Las secciones se desparafinaron con xileno y se hidrataron en una serie descendente de etanol. Para la tinción con H&E, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la tinción IHC, las secciones se incubaron con H2O2 al 0,3% durante 15 minutos para reducir la actividad de la peroxidasa endógena. La unión no específica se bloqueó con albúmina sérica bovina (BSA) durante 30 minutos y las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra Hp1α/β (1:200) o HMGB1 (1:200) a 4 °C durante la noche. Después de la incubación con un anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos a 37 °C, la unión del anticuerpo se visualizó mediante tinción con 3, 3'-diaminobencidina (DAB).

El potencial de membrana mitocondrial se evaluó utilizando el tinte JC-1 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se trataron con Doc y diacereína, y luego, se recogieron 1 x 105 células y se resuspendieron en 1 ml de medio DMEM/F12. Después de la incubación con colorante JC-1 (2,5 mg/l) durante 30 minutos en condiciones estándar de cultivo celular, la intensidad de fluorescencia de los monómeros y agregados de JC-1 mitocondrial se detectó utilizando un citómetro de flujo FACS Canto® Π con el software BD FACSDiva. El cambio en el potencial de membrana mitocondrial en cada grupo de células se calculó en función del porcentaje de monómeros JC-118.

Después del tratamiento con Doc y diacereína, se evaluó la señalización de la respuesta al daño del ADN detectando la expresión de γ-H2A.X (Tecnología de señalización celular) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se recogieron, se fijaron con formaldehído al 4% durante 15 minutos y se permeabilizaron con 2 ml de metanol al 90% helado durante 2 horas a -20 °C. Después de dos lavados con PBS para eliminar el metanol, las células se resuspendieron en 100 µl de PBS que contenía BSA al 0,5%. Las células se incubaron con el anticuerpo γ-H2A.X (Conjugado Alexa Fluor® 488) durante 1 h. Después de lavados con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo, las células se resuspendieron en 300 µl de PBS y la expresión de γ-H2A.X se analizó mediante un citómetro de flujo FACS Canto® Π con el software BD FACSDiva.

El ARN total se extrajo de las células mediante RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó un total de 1 µg de ARN como plantilla para una reacción de transcripción inversa utilizando un kit de transcripción inversa (TaKaRa Bio). Luego se analizó el ADNc generado mediante qPCR utilizando TB Green Premix Ex Taq (TaKaRa Bio) y se cuantificó utilizando sistemas de PCR en tiempo real ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las condiciones de termociclado de la PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min; 40 ciclos posteriores de 95 °C durante 30 s (s) y 60 °C durante 40 s. La expresión de ARNm del gen diana se analizó utilizando el método 2-ΔΔCt19 y se determinó mediante normalización a GAPDH (Homo) y β-Actina (Mus). Los cebadores utilizados se enumeran en el material complementario (archivo adicional 2 para la Tabla S3).

Cada experimento se repitió al menos tres veces y todos los resultados de los gráficos de barras se representan como la media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó mediante el software SPSS versión 20.0. Se utilizó la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos, y las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba post-hoc de LSD. Los valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. En los datos graficados *o#, **o## y ***o### denotan valores de P < 0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente.

Las líneas celulares de NSCLC A549 y NCI-H1299 se trataron con Doc durante 24 h y se les permitió recuperarse durante otros tres días. El diseño experimental se muestra en la Fig. 1A. Para determinar la influencia de Doc en el destino celular, primero analizamos la distribución del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 1B, las fracciones de células A549 y NCI-H1299 en la fase G2/M aumentaron progresivamente de 19,73 ± 0,51 y 19,19 ± 1,76% a las 0 h a 60,76 ± 0,83 y 56,90 ± 1,33% a las 6 h (6 h). vs. 0 h, P < 0.05) y 81.53 ± 2.25 y 72.82 ± 2.33% a las 12 h (12 h vs. 0 h, P < 0.05). Sin embargo, se encontraron fracciones sub-G1 y super-G2 después de la exposición al Doc durante 24 h (Fig. 1B y suplemento, archivo adicional 3 para la Fig. S1), por lo que las fracciones de células A549 y NCI-H1299 en la fase G2/M disminuyeron. significativamente a 60,79 ± 8,20 y 31,05 ± 4,17% a las 24 h (24 h vs. 12 h, P <0,05). Estos datos indicaron que Doc indujo la detención del ciclo celular G2/M en ambas líneas celulares seguida de muerte celular y poliploidía.

Doc indujo la detención del ciclo celular G2/M y la formación de PGCC. (A) Diseño experimental. Las líneas celulares de NSCLC A549 y H1299 se trataron con Doc a 100 nM durante 24 h y luego se cultivaron en un medio libre de fármaco durante tres días. (B) La progresión del ciclo celular se detectó mediante citometría de flujo y se analizó mediante el software Flow Jo 7.6 después del tratamiento Doc durante 6 h, 12 h y 24 h. En los histogramas se presentó el porcentaje de células en la fase G2/M. (C) La morfología de las células se observó mediante un microscopio de fluorescencia después de teñir las células con Dil y Hochest 33.342 (× 200). Las flechas rojas indican las células con núcleo gigante. Barra = 100 µm. (D) El contenido de ADN de las células se analizó mediante citometría de flujo y la región marcada por la línea negra (P2) muestra las células poliploides (ADN> 4N). Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de PGCC (células poliploides). N = 3, los datos se mostraron como media ± DE. Se utilizó ANOVA unidireccional para determinar la significación estadística: *P < 0,05, ***P < 0,001 y ###P < 0,001.

Curiosamente, la morfología de las células expuestas a Doc durante 24 h había cambiado mucho de huso a plana, y el tamaño de estas células aumentó junto con la prolongación del tiempo de cultivo (suplementario, archivo adicional 4 para la figura S2). Por lo tanto, analizamos más a fondo la morfología de las células inducidas por Doc utilizando el tinte Dil y Hoechst 33342. El tamaño y los núcleos de las células aumentaron después del tratamiento con Doc y alcanzaron su mayor tamaño en el grupo Doc (24 h) + 3 días (Fig. 1C). Se observaron múltiples núcleos o núcleos gigantes incluso en una sola célula agrandada, que se denominó PGCC (Fig. 1C). El contenido de ADN de las células A549 y NCI-H1299 tratadas con Doc se analizó adicionalmente mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 1D, el porcentaje de PGCC aumentó considerablemente de 8,20 ± 4,53 y 4,83 ± 1,72 % en el grupo de control a 17,60 ± 3,86 y 26,37 ± 3,51 % en el grupo Doc (24 h) y a 44,07 ± 0,90 y 45,80. ± 1,73% en el grupo Doc (24 h) + 3 días, que fue significativamente mayor que en el grupo control y en el grupo Doc (24 h) (P <0,05). En conjunto, estos datos sugirieron que las PGCC podrían generarse a partir de células de NSCLC inducidas con Doc.

De acuerdo con la detención del ciclo celular, Doc inhibió la proliferación de células A549 y NCI-H1299. Como se muestra en la Fig. 2A, el número de células se redujo de 8,98 ± 0,28 y 8,18 ± 0,54 (× 104 células/cm2) en el grupo de control a 3,24 ± 0,53 y 3,78 ± 0,54 (× 104 células/cm2) en el grupo Doc. (24 h) y a 0,64 ± 0,17 y 0,75 ± 0,08 (× 104 células/cm2) en el grupo Doc (24 h) + 3 días, significativamente más que en el grupo control y en el grupo Doc (24 h) (P < 0,05). Además, el porcentaje de apoptosis en las células A549 y HCI-H1299 aumentó de 6,03 ± 0,76 y 8,40 ± 0,62% en el grupo de control a 13,73 ± 0,75 y 21,27 ± 0,21% en el grupo Doc (24 h) (Fig. 2B). Este resultado fue consistente con el aumento en las fracciones sub-G1 y super-G2 (suplementario, archivo adicional 3 para la figura S1). Con el aumento en el contenido de ADN y la formación de PGCC después de tres días de recuperación, el porcentaje de apoptosis en las células A549 y HCI-H1299 no aumentó más (Figs. 1C, 2B). Estos resultados sugirieron que Doc inhibió la proliferación de células NSCLC al inducir muerte celular y poliploidía.

Doc redujo la expresión de proteínas clave relacionadas con la progresión y proliferación del ciclo celular. (A) El número de células se contó en una cámara de hemocitómetro bajo un microscopio y se presentó en los histogramas. (B) La viabilidad celular se evaluó mediante citometría de flujo con doble tinción con 7-AAD y PE Anexina V. Q2: apoptosis temprana; Q4: apoptosis tardía; Q2 + Q4: subgrupo apoptótico; Q3: subgrupo viable. Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de apoptosis. (C) Se extrajeron las proteínas y luego se analizaron los niveles de expresión de Cdc2, p-Cdc2, RB, p-RB y E2F1 mediante transferencia Western. Se utilizó β-actina como control de carga. N = 3, los datos se mostraron como media ± DE. Se utilizó ANOVA unidireccional para determinar la significación estadística: ***P < 0,001 y ###P < 0,001.

Dado que Doc no solo indujo la detención del ciclo celular sino que también inhibió la proliferación celular, investigamos más a fondo el efecto de Doc en la expresión de proteínas clave relacionadas con el ciclo celular y la proliferación. Cdc2 (CDK1) es un regulador clave de la transición de fase G2/M20,21, y la inhibición de CDK puede bloquear la fosforilación de la proteína del retinoblastoma (RB), impidiendo así la transcripción de genes proliferativos mediados por E2F22. Por lo tanto, la expresión de Cdc2, p-Cdc2, RB, p-RB y E2F1 se analizó mediante transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 2C, los niveles de proteína de Cdc2 y p-Cdc2 se redujeron después del tratamiento con Doc, particularmente en el grupo Doc (24 h) + 3 días. En consecuencia, se observó una menor expresión de RB y p-RB en el grupo Doc (24 h) + 3 días (Fig. 2C). El nivel de proteína de E2F1 también se redujo, particularmente en el grupo Doc (24 h) + 3 días (Fig. 2C). Por lo tanto, Doc podría inducir a las células NSCLC a formar PGCC modulando la expresión de proteínas reguladoras clave relacionadas con el ciclo celular y la proliferación.

Las PGCC inducidas por doctores revelaron algunos rasgos característicos de la senescencia, como una morfología agrandada y aplanada (suplementario, archivo adicional 4 para la figura S2), así como detención irreversible del ciclo celular e inhibición de la proliferación (figuras 1B, 2A). Para confirmar que las PGCC inducidas por Doc experimentaron senescencia, utilizamos un kit de tinción SA-β-Gal para detectar la actividad de la β-galactosidasa. Se incluyó doxorrubicina (132 nM) como control positivo para mostrar la inducción de senescencia23. Como se muestra en la Fig. 3A, las células A549 y NCI-H1299 se agrandaron y aplanaron después del tratamiento con Doc y mostraron una mayor actividad de β-galactosidasa (P <0,05). La tinción positiva de β-galactosidasa se concentró principalmente en células grandes, particularmente en el grupo Doc (24 h) + 3 días (Fig. 3A). Por lo tanto, Doc indujo un fenotipo senescente con el desarrollo de PGCC.

Los PGCC inducidos por Doc experimentaron senescencia. (A) Las células se tiñeron con un kit de tinción de β-galactósido asociado a la senescencia (SA-β-Gal) y las imágenes se adquirieron con un microscopio invertido (× 200). Las flechas negras indican la célula positiva para SA-β-Gal. Barra = 100 µm. Se usó doxorrubicina (132 nM) como control positivo para mostrar la inducción de senescencia. (B) Se extrajeron las proteínas y luego se analizó el nivel de proteína de p53 y p21 mediante transferencia Western. Se utilizó β-actina como control de carga. (C) La expresión de γ-H2A.X se analizó mediante citometría de flujo y la región marcada por la línea negra (P2) mostró las células positivas para γ-H2A.X. Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de células positivas para γ-H2A.X. N = 3, los datos se mostraron como media ± DE. Se utilizó ANOVA unidireccional para determinar la significación estadística: **P < 0,01, ***P < 0,001 y ###P < 0,001.

La vía de señalización p53/p21 juega un papel importante en la regulación de la progresión del ciclo celular, y la señalización activada de p53/p21 es típica del estrés/senescencia celular24,25. Por tanto, la expresión de las proteínas p53 y p21 se evaluó mediante transferencia Western. Después del tratamiento con Doc, el nivel de proteína de p21 aumentó significativamente, particularmente en el grupo Doc (24 h) + 3 días (Fig. 3B). Aunque Doc aumentó el nivel de proteína de p53 en las células A549, la inducción de p21 fue independiente de p53 ya que las células NCI-H1299 eran p53 nulas (Fig. 3B). Estos datos sugirieron que la expresión de p21 podría estar relacionada con la formación de PGCC y la aparición de senescencia. La respuesta al daño del ADN es un mecanismo importante que provoca la senescencia24. Por lo tanto, la expresión de γ-H2A.X (un marcador de respuesta al daño del ADN) se analizó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3C, el porcentaje de células γ-H2A.X positivas en las células A549 y NCI-H1299 aumentó de 36,00 ± 1,65 y 55,43 ± 2,84% en el grupo de control a 52,07 ± 1,03 y 72,13 ± 3,52% en el grupo Doc (24 h) y más a 59,90 ± 2,04 y 76,57 ± 4,25% en el grupo Doc (24 h) + 3 días, significativamente más que en el grupo control (P <0,05). Estos datos sugirieron que la activación de la respuesta al daño del ADN podría estar relacionada con la formación de PGCC y la aparición de senescencia. En conjunto, estos datos indicaron claramente que Doc no solo indujo PGCC sino que también promovió la senescencia, y estos dos procesos podrían estar controlados por p21 y la señal de respuesta al daño del ADN.

La senescencia celular se acompaña de un sorprendente aumento en los niveles secretados de factores solubles13. Estábamos particularmente interesados ​​en explorar la contribución de las citoquinas proinflamatorias asociadas a la senescencia a la formación de PGCC y la senescencia. Por lo tanto, los niveles de ARNm de IL-1β, IL-6 e IL-8 se analizaron mediante RT‒qPCR, ya que estas importantes moléculas inflamatorias están involucradas en la senescencia y se expresan predominantemente en PGCC26. Como se esperaba, los niveles de ARNm de IL-1β en las células A549 y NCI-H1299 aumentaron 3,6 ± 0,1 y 2,6 ± 0,8 veces en el grupo Doc (24 h) y 10,3 ± 0,5 y 30,3 ± 4,1 veces en el grupo Doc. (24 h) + grupo de 3 días en comparación con el del grupo de control (Fig. 4A, P <0,05). Además, los niveles de ARNm de IL-8 en las células A549 y NCI-H1299 aumentaron 8,9 ± 1,0 y 18,0 ± 3,6 veces en el grupo Doc (24 h) y 27,2 ± 1,6 y 35,9 ± 6,2 veces en el grupo Doc ( 24 h) + grupo de 3 días en comparación con el del grupo de control (Fig. 4A, P <0,05). Sin embargo, el nivel de ARNm de IL-6 no cambió significativamente con el tratamiento con Doc (datos no mostrados). Estos datos indicaron que el tratamiento con Doc aumentó la expresión de IL-1β e IL-8 con el desarrollo de PGCC in vitro.

Doc promovió la expresión de IL-1β in vitro y vivo. (A) El nivel de ARNm de IL-1β e IL-8 se determinó mediante RT‒qPCR. Los valores se normalizaron a GADPH (Homo sapiens) y se relacionaron con el grupo control. (B) Características histológicas después de la tinción con H&E de ratones desnudos xenoinjertados con células A549 con o sin tratamiento Doc. Barra = 100 µm. Los gráficos de barras mostraron el número relativo de PGCC. El porcentaje de PGCC (aproximadamente tres veces el área mononuclear promedio) se cuantificó y normalizó para el grupo de PBS (control) (N = 15). (C) Análisis inmunohistoquímico de HP1α/β y HMGB1 expresados ​​en tejidos tumorales de ratones desnudos xenoinjertados con células A549. Barra = 50 µm. Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de células positivas. La expresión de HP1α/β y HMGB1 se cuantificó según el porcentaje de células positivas (N = 8). (D) La expresión relativa del ARNm de IL-1β en los tejidos tumorales de ratones desnudos xenoinjertados con células A549 se determinó mediante RT‒qPCR. Los valores se normalizaron con respecto a actina (Mus musculus) y con respecto al grupo de PBS (control). N = 3, los datos se mostraron como media ± DE. Se utilizaron ANOVA unidireccional y la prueba t de Student para determinar la significación estadística: *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.

El modelo de tumor de xenoinjerto A549 se estableció para investigar el efecto de Doc en las células tumorales in vivo. La tinción con H&E mostró que el tratamiento con Doc condujo a la formación de PGCC con núcleos extraños (Fig. 4B). Además, Doc promovió notablemente la expresión de HP1α/β y HMGB1 (proteínas marcadoras de senescencia) a nivel histológico (Fig. 4C). Estos datos sugirieron que Doc indujo la formación de PGCC y senescencia in vivo. Con base en los datos observados in vitro, analizamos más a fondo el efecto de Doc sobre la expresión de IL-1β e IL-8 in vivo. Dado que la IL-8 está eliminada en ratones, se analizó el nivel de ARNm de IL-1β en ratones portadores de tumores tratados con Doc mediante RT-qPCR. De acuerdo con los resultados in vitro, el nivel de ARNm de IL-1β aumentó significativamente 23,3 ± 0,6 veces después del tratamiento con Doc en comparación con el del grupo de PBS (Fig. 4D, P <0,05). En conjunto, estos datos sugirieron que Doc promovió la senescencia y la expresión de IL-1β con el desarrollo de PGCC in vivo.

Para investigar el efecto de la IL-1β sobre la formación y el desarrollo de PGCC, utilizamos diacereína como inhibidor de la IL-1β. Como se muestra en la Fig. 5A, la diacereína bloqueó parcialmente la inducción de IL-1β por Doc. El efecto de la inhibición de IL-1β sobre la senescencia celular se evaluó analizando la expresión de γ-H2A.X. La diacereína redujo significativamente la expresión de γ-H2A.X, ya sea sola o en combinación con Doc. Como se muestra en la Fig. 5B, el tratamiento con diacereína sola redujo el porcentaje de células positivas para γ-H2A.X en células A549 y NCI-H1299 de 35,87 ± 0,76 y 49,70 ± 0,46% en el grupo de control a 30,70 ± 0,53 y 34,93 ± 1,12% en el grupo Dia (grupo Dia versus grupo control, P <0,05). Es importante destacar que el tratamiento con Doc y diacereína en combinación redujo el porcentaje de células γ-H2A.X positivas de 52,23 ± 0,31 y 60,63 ± 0,21 % en el grupo Doc a 49,23 ± 0,55 y 41,70 ± 0,95 % en el grupo Doc + Dia ( Grupo Doc + Dia versus grupo Dia, P <0,05). El efecto de la inhibición de IL-1β sobre el desarrollo de PGCC se evaluó adicionalmente mediante análisis del contenido de ADN con citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 5C, el tratamiento con diacereína sola no aumentó el porcentaje de PGCC en las células A549 y NCI-H1299 (grupo Dia frente a grupo control, P > 0,05). Sin embargo, el tratamiento con Doc y diacereína en combinación aumentó el porcentaje de PGCC en las células A549 y NCI-H1299 de 33,70 ± 0,70 y 37,77 ± 0,93 % en el grupo Doc a 55,53 ± 0,81 y 42,53 ± 1,25 % en el grupo Doc + Dia ( Grupo Doc + Dia versus grupo Doc, P <0,05). Estos datos indicaron que la inhibición de IL-1β promovió sinérgicamente la formación de PGCC con la inducción de Doc.

La inhibición de IL-1β obstaculizó la senescencia y facilitó el desarrollo de PGCC. (A) La expresión relativa del ARNm de IL-1β se determinó mediante RT-qPCR. Los valores se normalizaron para GADPH y en relación con el grupo de control. (B) La expresión de γ-H2A.X se analizó mediante citometría de flujo y la región marcada por la línea negra (P2) mostró células positivas para γ-H2A.X. Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de células positivas. (C) El contenido de ADN de las células se analizó mediante citometría de flujo y la región marcada por la línea negra (P2) muestra las células poliploides (ADN> 4N). Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de PGCC (células poliploides). (D) El potencial de membrana mitocondrial se determinó mediante citometría de flujo. Los gráficos de barras mostraron el porcentaje de monómeros JC-1. N = 3, los datos se mostraron como media ± DE. Se utilizó ANOVA unidireccional para determinar la significación estadística: ***P < 0,001, #P < 0,05 y ###P < 0,001.

Se midió el potencial de membrana mitocondrial para evaluar el efecto de la IL-1β sobre la viabilidad celular utilizando el tinte JC-1. Como se muestra en la Fig. 5D, el tinte JC-1 existía en forma de agregados en el grupo de control y en el grupo Dia de células A549 y NCI-H1299 (grupo Dia versus grupo control, P > 0,05), lo que sugiere que el tratamiento con diacereína sola no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular. Después del tratamiento con Doc solo, las proporciones de la forma monomérica JC-1 en las células A549 y NCI-H1299 aumentaron significativamente de 2,70 ± 0,75 y 2,37 ± 1,17 % en el grupo de control a 35,97 ± 1,62 y 56,40 ± 1,78 % en el grupo Doc. grupo (Fig. 5D, grupo Doc versus grupo control, P <0,05). En particular, el tratamiento con Doc y diacereína en combinación aumentó aún más las proporciones de la forma monomérica JC-1 en las células A549 y NCI-H1299 a 42,97 ± 2,08 y 64,40 ± 1,49 %, significativamente más que en el grupo Doc (Fig. 5D, Grupo Doc + Dia versus grupo Doc, P <0,05). Estos datos sugirieron que Doc provocó la despolarización del potencial transmembrana mitocondrial para inducir la apoptosis y que la inhibición de IL-1β mejoró sinérgicamente el efecto proapoptótico de Doc.

La quimioterapia es uno de los métodos terapéuticos tradicionales para los tumores malignos. Aunque los medicamentos de quimioterapia pueden eliminar las células cancerosas al inducir la muerte celular mediante apoptosis, autofagia o catástrofe mitótica, la resistencia a los medicamentos ocurre a menudo e inevitablemente27. Los medicamentos de quimioterapia, como Doc, pueden dañar el huso mitótico y detener la mitosis, lo que conduce a una catástrofe mitótica y una muerte celular sustancial26. Sin embargo, los fármacos de quimioterapia también provocan un cambio del ciclo celular mitótico al ciclo celular de endorreplicación, lo que conduce a la formación de PGCC, una forma más propicia para adaptarse al duro entorno de vida28. La formación de PGCC después de una intervención terapéutica con fármacos quimioterapéuticos, incluido Doc, ha sido bien descrita. Estos PGCC pueden adquirir un fenotipo secretor proinflamatorio y contribuir a la adquisición de quimiorresistencia29. Aquí, descubrimos que Doc podría inducir la detención del ciclo celular G2/M y la muerte celular en células A549 y NCI-H1299. Al mismo tiempo, Doc indujo PGCC, que mostraban características típicas de senescencia. La citoquina inflamatoria IL-1β en el SASP aumentó significativamente con el desarrollo de PGCC y contribuyó a la resistencia a Doc.

La senescencia celular se identificó originalmente como un estado estable de detención del ciclo celular e inhibición de la proliferación, que también se considera una respuesta de estrés que puede desencadenarse en las células cancerosas en respuesta a la irradiación o a los fármacos de quimioterapia30,31, denominada senescencia inducida por terapia (TIS). La senescencia celular se ha considerado durante mucho tiempo como sinérgica con la prevención y el control de tumores malignos y se reconoce cada vez más como un concepto importante en la biología del cáncer32. Sin embargo, TIS no parece ser beneficioso, ya que puede provocar quimiorresistencia y recurrencia del cáncer. Jackson y cols. encontraron que la senescencia podría perjudicar la eficacia de la quimioterapia y promover la recurrencia del cáncer de mama33. Wang y cols. demostraron que un marcador de TIS in vivo después de la terapia neoadyuvante predijo resultados clínicos adversos en pacientes con NSCLC localmente avanzado27. Estudios recientes han revelado que atacar selectivamente y eliminar eficazmente las células senescentes in vivo puede promover significativamente los resultados terapéuticos y alargar la vida útil de los animales de experimentación34,35. En la práctica clínica, la senescencia puede ser un punto clave a examinar después de la quimioterapia. En este estudio, nos centramos en el efecto de Doc sobre la senescencia celular. Nuestro estudio sugiere que el tratamiento con Doc conduce a la senescencia celular y que la citocina inflamatoria IL-1β en el SASP contribuye a la resistencia a Doc. IL-1β no sólo es un importante factor inflamatorio secretado por células senescentes, sino que también participa directa o indirectamente en la senescencia. Ashraf et al. destacaron que la IL-1β es el gen más crítico responsable de la inducción directa de la senescencia para cambiar las características fenotípicas y moleculares de los condrocitos36. Li y col. y Chen et al. También demostró que la IL-1β aumentaba notablemente la expresión de SA-β-Gal37,38. Además, la IL-1β es fundamental para la respuesta inflamatoria y activa una gran cantidad de vías de señales, incluidas p38 MAPK, JNK, ERK y NF-κB. Estas vías de señalización pueden conducir a la transcripción de genes diana implicados en la senescencia, como la IL-6 y la IL-8, que inducen un entorno inflamatorio/de senescencia autoreforzado y reforzado de forma cruzada39.

La IL-1β es una importante citocina proinflamatoria implicada en el estrés y la inflamación crónica40. La inflamación crónica es un factor importante en la carcinogénesis y la progresión tumoral, y la inflamación relacionada con el cáncer se considera un marcador importante de cáncer41,42. Aunque la IL-1β se ha estudiado ampliamente en células inmunitarias, estudios recientes han demostrado que las células tumorales también expresan IL-1β, que puede ser producida directamente por células cancerosas tratadas con varios fármacos quimioterapéuticos43. Sin embargo, se ha demostrado que la IL-1β tiene un efecto positivo sobre la quimiorresistencia. Varios estudios han propuesto un papel de la IL-1β en las malas respuestas a la quimioterapia con los consiguientes fracasos del tratamiento44,45. Lin Lu et al. demostraron que la IL-1β promueve la resistencia a los medicamentos del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y de las células de melanoma46. Alejandro y col. informaron que las células cancerosas quimiorresistentes pueden liberar IL-1β, que mantiene un bucle de amplificación de NF-κB responsable de la quimiorresistencia47. Ji-Won Kim y col. encontraron que los niveles altos de IL-1β se asocian con una supervivencia general más corta y libre de progresión para pacientes con NSCLC tratados con quimioterapia combinada basada en platino48. La IL-1β puede promover la resistencia a los medicamentos y la supervivencia del tumor y está surgiendo como un factor pronóstico para los pacientes en respuesta a la terapia dirigida, lo que convierte a la IL-1β en un posible objetivo que puede ser necesario tener en cuenta.

En este estudio, demostramos por primera vez que la IL-1β desempeña un papel importante en la resistencia del NSCLC a la quimioterapia Doc a través de su participación en la formación de PGCC y la aparición de senescencia. Por lo tanto, es razonable que apuntar a la IL-1β en las PGCC pueda ser un enfoque novedoso para superar la resistencia a los medicamentos.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles a través de solicitud razonable del autor correspondiente.

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Este trabajo fue financiado por el plan clave de orientación de investigación y desarrollo de la provincia de Liaoning (CN) en 2019 (2019JH8/10300082).

Laboratorio de Medicina Básica, Hospital General del Comando del Teatro del Norte, No. 83 Wenhua Road, Distrito de Shenhe, Shenyang, 110016, Liaoning, China

Song Zhao, Sining Xing, Lili Wang, Mingyue Ouyang, Shuo Liu, Lingyan Sun y Huiying Yu

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HY, SZ, MO y LW diseñaron el estudio. SZ, SX, MO, LW y SL prepararon material y realizaron experimentos con la ayuda de HY. SZ, SX, MO y LW recopilaron y analizaron los datos. SZ redactó el manuscrito y todos los autores comentaron versiones anteriores del manuscrito. SZ, LS y HY contribuyeron a la revisión repetida del manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Huiying Yu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zhao, S., Xing, S., Wang, L. et al. La IL-1β participa en la quimiorresistencia al docetaxel al regular la formación de células cancerosas gigantes poliploides en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Informe científico 13, 12763 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39880-2

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Recibido: 20 de abril de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39880-2

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